АРТ
EN

Технология in vivo оплодотворения лошадей

Протокол ZOOEMBRIO выстроен вокруг четырёх последовательных этапов. Каждая среда решает конкретную задачу и используется в строго определённой точке процесса.

Преимущества технологии получения и вымывания ооцитов

Трансвагинальная аспирация ооцитов (OPU) с последующим вымыванием — основа in vivo протокола для лошадей

В отличие от классического флашинга эмбрионов, при котором кобыла должна быть оплодотворена и вынашивать эмбрион, технология аспирации ооцитов позволяет получать половые клетки напрямую из яичника живой кобылы. Первый и критически важный лабораторный шаг после аспирации — вымывание: отделение ооцитов от фолликулярной жидкости в специализированной среде с сохранением их жизнеспособности.

1

Генетика ценных кобыл без беременности

Ооциты можно получить от выдающихся маток, не нагружая их вынашиванием потомства. Это особенно важно для племенных программ, где донорша продолжает выступать или используется ограниченно.

2

Подходит спортивным кобылм

Аспирацию планируют в удобное окно вне соревновательного сезона или между стартами. Процедура занимает около 30–40 минут под седацией, после чего кобыла может вернуться к обычному режиму.

3

Решение для проблемных маток

Если классическое воспроизводство не даёт результата — хронический эндометрит, возрастные изменения, травмы половых путей — получение ооцитов напрямую из яичника открывает путь к продолжению племенной линии.

4

Гибкое планирование в течение года

Аспирацию проводят при наличии фолликулов подходящего размера, не привязываясь жёстко к одному дню овуляции. Повторные процедуры возможны с интервалом 2–3 недели в течение сезона.

5

Криоконсервация и логистика

Ооциты и эмбрионы можно витрифицировать и хранить в жидком азоте, перенося в удобное время. Это снимает необходимость жёсткой синхронизации донорской и реципиентной кобыл.

6

Качество вымывания определяет исход

После аспирации ооциты чувствительны к составу среды, температуре и времени обработки. Правильное вымывание в TSM-Asp сохраняет морфологию клеток и задаёт успех всего последующего протокола — отмывки, заморозки и разморозки.

Именно поэтому каждый этап после аспирации требует специализированной среды. Ниже — как устроен протокол ZOOEMBRIO и какие решения мы предлагаем на каждом шаге.

Линейка сред ZOOEMBRIO покрывает полный цикл: вымывание, отмывка, витрификация и разморозка. Для каждого этапа — подробное описание процесса и рекомендуемая среда.

Схема аспирации ооцитов из яичника кобылы и вымывания в среде TSM-Asp

Схема аспирации ооцитов из яичника кобылы и вымывания в среде TSM-Asp

TSM-Asp

Этап 1 Вымывание ооцитов

Что это

Ооцит — женская половая клетка, которая созревает во фолликуле яичника кобылы. При in vivo протоколе ооциты получают трансвагинальной аспирацией: через стенку прямой кишки вводят ультразвуковой датчик и аспирационную иглу, фолликулы пунктируют и собирают фолликулярную жидкость с клетками. Вымывание — это отделение ооцитов от этой жидкости и клеточного «мусора» в специальной среде, чтобы клетки остались жизнеспособными.

Как выполняется этап

  1. Кобылу готовят к процедуре: седируют, фиксируют, проводят гигиеническую обработку.
  2. Под ультразвуковым контролем пунктируют фолликулы яичника и аспирируют содержимое в пробирку с небольшим объёмом среды.
  3. Фолликулярную жидкость переносят в сосуд с мягкой средой TSM-Asp — она поддерживает ооциты во время поиска и отбора.
  4. Под микроскопом находят ооциты, переносят в свежую порцию TSM-Asp и промывают от остатков фолликулярной жидкости.
  5. Отобранные ооциты культивируют или сразу передают на следующий этап — отмывку.
TSM-Asp

TSM-Asp поставляется в мешках для инфузий 1000 и 3000 мл — объём удобен для вымывания большого количества фолликулярной жидкости без частых переливаний.

Схема отмывки ооцитов в каплях среды Wash

Схема отмывки ооцитов в каплях среды Wash

Wash

Этап 2 Отмывка ооцитов

Что это

После вымывания на поверхности ооцитов остаются следы фолликулярной жидкости, клеток гранулёзной оболочки и других компонентов. Отмывка — это серия кратковременных переносов клетки через свежие порции среды, чтобы удалить эти остатки и подготовить ооцит к витрификации или дальнейшему культивированию.

Как выполняется этап

  1. Ооциты переносят из среды TSM-Asp в каплю среды Wash на предварительно прогретой пластине.
  2. Клетку «промывают» — переносят в следующую каплю Wash, не допуская пересыхания капель.
  3. Обычно выполняют 3–5 переносов, пока ооцит не будет очищен от видимых прилипших элементов.
  4. После отмывки оценивают качество ооцитов (стадия созревания, морфология) и отбирают кандидатов на заморозку.
  5. Подготовленные ооциты передают на этап витрификации.
Wash

Wash выпускается во флаконах 50 и 100 мл — удобный формат для лабораторной работы с пипеткой и каплями на нагревательной пластине.

Схема витрификации ооцитов с наборами ViT1 и ViT2

Схема витрификации ооцитов с наборами ViT1 и ViT2

ViT1 / ViT2

Этап 3 Заморозка (витрификация)

Что это

Витрификация — сверхбыстрая заморозка, при которой клетка переходит в стеклообразное состояние без образования льда. Это позволяет сохранить ооциты и эмбрионы лошадей для длительного хранения в жидком азоте (−196 °C) с высокой выживаемостью после разморозки.

Как выполняется этап

  1. Ооциты эквилибрируют в среде ViT1 — она подготавливает клетку к воздействию криопротекторов.
  2. Клетку переносят в концентрированную среду ViT2 на короткое время (секунды).
  3. Ооцит быстро погружают на криотоп или в криосоломинку и немедленно опускают в жидкий азот.
  4. Замороженные криотопы помещают в криохранилище для длительного хранения.
  5. Каждая партия ViT1/ViT2 готовится и применяется по протоколу с контролем температуры и времени экспозиции.
ViT1 / ViT2

Набор ViT1 + ViT2 — двухступенчатая система: первая среда для эквилибрации, вторая — для финальной витрификации.

Схема разморозки ооцита в водяной бане со средами WaM1 и WaM2

Схема разморозки ооцита в водяной бане со средами WaM1 и WaM2

WaM1 / WaM2

Этап 4 Разморозка

Что это

Разморозка — обратный процесс витрификации. Замороженный ооцит извлекают из жидкого азота, быстро нагревают и поэтапно выводят из криопротекторов в рабочую среду. Цель — восстановить жизнеспособность клетки для культивирования, оплодотворения или переноса.

Как выполняется этап

  1. Криотоп извлекают из жидкого азота и сразу погружают в водяную баню 37 °C на несколько секунд.
  2. Ооцит переносят в среду WaM1 — она начинает удаление криопротекторов.
  3. Последовательно переносят через порции WaM1 и WaM2 с соблюдением времени экспозиции.
  4. После разморозки оценивают морфологию ооцита и его пригодность для дальнейшего использования.
  5. Восстановленные ооциты используют в программе оплодотворения или культивирования.
WaM1 / WaM2

Набор WaM1 + WaM2 обеспечивает плавный переход клетки из витрифицированного состояния в рабочую среду без осмотического шока.

Все манипуляции выполняются с соблюдением температурного режима и стандартных лабораторных практик. Перед применением среды проходят необходимую эквилибрацию.